SARS-CoV-2新型冠状病毒RT-LAMP试剂盒(N基因)

产品货号：

BTN16-81920Ny

中文名称：

SARS-CoV-2新型冠状病毒RT-LAMP试剂盒(N基因)

英文名称：

SARS-CoV-2 N Gene Visual RT-LAMP Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

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本产品根据基于双染料RT-LMAP技术开发了专门检测的新型冠状病毒N基因RT-LAMP检测试剂盒，仅供科研使用。

背景资料

新型冠状病毒(SARS-Cov-2)是单股正链RNA病毒，发现于2019年。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，因此新型冠状病毒的快速准确鉴定有重要意义。新型冠状病毒N基因编码的N蛋白是病毒粒子的核心成分，它与病毒基因组RNA结合，将RNA包装成核糖核蛋白(RNP)复合体。除了组装外，N蛋白还在病毒mRNA转录和复制中发挥重要作用，并参与免疫调节。N基因相对保守，故是早期快速诊断和疫苗研发的关键靶标。

产品特点

即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
检测灵敏性一般比RT-PCR高10倍以上，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应左右。
特异性高，根据新型冠状病毒N基因RNA保守序列设计6条特异引物，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
荧光检测时，阳性样品一般15分钟开始起峰，阴性样本一般60分钟内不会起峰。
提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达到13μL。
内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
本产品足够50次20μL体系的染料法荧光及可视化RT-LAMP扩增。
只可用于科研。

组分	规格
RT-LAMP MasterMix(双染料，待加酶)	200μL
逆转录酶-扩增酶混合液	100μL
20×新型冠状病毒N基因RT-LAMP引物混合液	50μL
新型冠状病毒N基因RT-LAMP阳性对照(1×10⁴拷贝/μL)	250μL
超纯水	1mL

保存：-20℃，有效期一年。

使用方法

一、样品RNA的制备

用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的包膜病毒核酸释放剂。
如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PC)和一个样品制备阴性对照(NC)。PC可以用10μL本试剂盒提供的阳性对照(1×10⁴拷贝/μL)加一定量的水得到，其总体积必须跟核酸提取试剂盒所要求的起始样品相同，NC用水替代。

二、RT-LAMP反应(20μL体系)

注意：第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100μL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix(双染料，待加酶)中，盖上盖子后轻柔颠倒1分钟混匀，然后再取用。

反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，需要设置N+4个RT-LAMP扩增，增加RT-LAMP阴性对照和RT-LAMP阳性对照。在N+4个PCR管中加入下列成分：

成分	N+2个样品管	RT-LAMP 阴性对照	RT-LAMP 阳性对照
RT-LAMP MasterMix(双染料，已加酶)	各6μL	6μL	6μL
20×新型冠状病毒N基因RT-LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
N+2个样品RNA	各13μL	-	-
超纯水	-	13μL	-
新型冠状病毒N基因RT-LAMP阳性对照(1×10⁴拷贝/μL)	-	-	13μL

本产品含两种染料，故最好使用荧光PCR仪器进行扩增。设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

三、结果分析

电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL RT-LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-LAMP阳性对照必须有正常RT-LAMP条带(200bp左右的梯形扩增产物)，RT-LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果RT-LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：
可将光(肉眼)分析：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图(9为阴性，10为阳性)。
荧光分析(仅限于用qPCR仪进行反应的场景)：样品制备阳性对照和RT-LAMP阳性对照的荧光信号将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和RT-LAMP阴性对照的荧光信号呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。

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